» » Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Узко-специализированная часть сайта (Orthodox.od.ua) состоит только из ответов на вопросы, которые задают пациенты на приеме.


Календарь новостей

«    Июль 2019    »
ПнВтСрЧтПтСбВс
1234567
891011121314
15161718192021
22232425262728
293031 

Обмен ссылками


Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

09.11.10, посмотрело: 8569

0

Что такое ПЦР?

Полимеразная цепная реакция (Polymerase chain reaction), более известная как "ПЦР" (PCR) не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он и был удостоен Нобелевской премии. Причина достаточно проста: ПЦР делает невозможное возможным.

Часто её описывают как метод, с помощью которого ученые могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл.

"Иглой" является крошечный фрагмент генетического материала клеток, представленный в виде ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) или РНК (рибонуклеиновая кислота), которые в свою очередь состоят из нескольких миллиардов нуклеотидов. Примечательно, если нить ДНК вытянуть, то ее длина составит около 2 метров. Но в составе клеточного ядра она настолько компактно свернута в спираль, что ее диаметр составляет сего лишь тысячную миллиметра.

Так что же происходит во время ПЦР?

ПЦР имитирует естественный процесс репликации (размножения) ДНК, в результате чего, в течение нескольких часов из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 50 млрд. идентичных молекул. Таким образом, можно изучить генетический материал, присутствующий в крошечных количествах.

В настоящее время ПЦР широко применяется в таких областях, как археология, судебная экспертиза, генетика, в определении отцовства, и особенно в медицине для диагностики инфекционных болезней.

ПЦР в диагностике инфекционных болезней

ПЦР - метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций "золотым стандартом", проверенный временем и тщательно апробированный клинически.

Достоинства метода ПЦР:

 

  1. Среди методов диагностики инфекционных возбудителей, ПЦР обладает наиболее высокими показателями чувствительности (за счет экспоненциального накопления фрагментов ДНК) и специфичности (за счет выявления уникальных для микро-(макро)-организмов участков генетического материала).
    Аналитическая чувствительность АмплиСенс ПЦР-тест-систем для большинства вирусов и бактерий - 1000 микроорганизмов в 1 мл биологического материала.
    Специфичность ПЦР при использовании технологии АмплиСенс для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%.
  2. Возможность использования разнообразного клинического материала.
  3. Возможность одновременного выявления нескольких микроорганизмов в одной биологической пробе, в отличие от бактериологических методов, где для разных возбудителей используются разные способы культивирования.
  4. Простые требования к условиям хранения и транспортировки материала от пациента в лабораторию. Повышена стабильность при транспортировке до лаборатории, поскольку нет необходимости сохранять возбудителя в живом виде, в отличие от бактериологических и вирусологических методов.
  5. Скорость проведения анализа: время получения результатов, для некоторых инфекций меньше, чем 24 часа.
  6. Для некоторых микроорганизмов (например, Mycoplasma genitalium) ПЦР – единственный метод диагностики.

Но, несмотря на все достоинства ПЦР, преимущественное его использование для выявления инфекционного возбудителя применимо не ко всем микроорганизмам.

Так, например, для таких возбудителей как стафилококк или стрептококк лучше использовать микробиологический метод, а для диагностики бруцеллеза, бореллиоза, токсоплазмоза, краснухи, кори – целесообразнее использовать иммунологические методы (например, ИФА).

ПЦР в диагностике инфекционных болезней

ИППП широко распространены во всем мире. К ним относятся:

Бактерии Возбудитель сифилиса (Treponema pallidum)
Возбудитель гонореи (Neisseria gоnorrhoeae)
Хламидия (Chlamydia trachomatis)
Микоплазмы (Mycoplasma genitallium, Mycoplasma hominis)
Уреаплазма (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum)
Вирусы ВИЧ (HIV)
Генитальный герпес (HSV2)
Папилломавирус (HPV)
Простейшие Трихомонада (Trichomonas vaginalis)
Грибы Возбудитель кандидоза (Candida spp.)

Большинство вышеперечисленных инфекций протекают со схожей симптоматикой, могут приобретать затяжное, хроническое течение, что приводит к развитию осложнений (воспалительные заболевания органов малого таза, нарушение репродуктивной функции, осложнения в процессе беременности и др.). Исходя из вышесказанного, совершенно очевидно, насколько важно своевременное выявление этих возбудителей.

Метод ПЦР

 

  1. Определить этиологию инфекции (т.е. какой именно микроорганизм или их сочетание вызвали воспалительный процесс). Для некоторых возбудителей, например, Mycoplasma genitallium (010102), ПЦР – это единственный метод диагностики на сегодняшний день. В зависимости от ответа на данный вопрос вырабатывается тактика лечения.
  2. Определить количество возбудителя. Особенно это актуально для условно-патогенных микроорганизмов (Gardnerella vaginalis (010202) и др.), которые вызывают патологию только при определенных условиях (например, при повышении концентрации).
  3. Осуществить контроль за течением инфекционного процесса и оценить эффективность лечения. Однако необходимо учитывать тот факт, что ПЦР может улавливать даже единичные фрагменты ДНК, которые могут оставаться некоторое время после лечения, в связи с чем, контроль эффективности проводимой терапии рекомендуется проводить не ранее чем через 2-3 недели после ее окончания.

Благодаря своей высокой чувствительности, ПЦР позволяет выявлять возбудителя даже при минимальном его содержании. Особенно это актуально при бессимптомном течении инфекционного процесса, вызванного безусловно-патогенными микроорганизмами (гонорея, трихомоноз (020201), хламидийная инфекция (010001)). Например, при хронической гонорее у женщин даже с помощью бактериологического метода часто не удается выявить гонококк, несмотря на имеющиеся симптомы хронического воспалительного процесса в шейке матки или уретре.

ПЦР в диагностике гепатитов

В настоящее время известно как минимум 5 вирусов, способность которых вызывать поражение печени доказана. Это вирусы гепатита А, В, С, D, Е. В редких случаях гепатит может быть вызван вирусом Эпштейна-Барр, вирусом простого герпеса. Способность поражать печень таких агентов как вирус ТТ, вирус гепатита G сегодня признается не всеми. Все вышеперечисленные вирусы относятся к различным семействам, имеют разные биологические свойства и соответственно, тактика лечения будет тоже значительно отличаться в зависимости от этиологии гепатита.

Учитывая вышеизложенное, весьма актуальной проблемой является адекватная этиологическая диагностика вирусных гепатитов, которая невозможна без использования современных молекулярно-биологических методов, одним из которых является ПЦР.

Итак, в чем же состоит достоинство ПЦР в диагностике гепатитов? Попробуем разобраться:

 

  1. Вирусный гепатит А (ВГА): ПЦР используется для обследования контактных лиц и более раннего выявления заболевших гепатитом А в очагах инфекции (например, в детском коллективе), т.к. РНК вируса гепатита А (030002) появляется в крови больного гепатитом А гораздо раньше, чем антитела (anti-HAV IgM) (040002). И еще один важный момент! Считается, что через неделю после появления клинических симптомов, больной гепатитом А перестает быть заразным… Но это касается только фекально-орального пути передачи вируса. В крови больного гепатитом А вирус присутствует гораздо дольше (иногда до нескольких месяцев), т.е. возможность заражения гепатитом А через кровь не ограничивается вышеуказанными сроками, и ПЦР единственный метод, с помощью которого возможно осуществлять мониторинг вирусемии (наличия вируса в крови).
  2. Вирусный гепатит В (ВГВ): в диагностике вирусного гепатита В ПЦР имеет свои неоценимые достоинства:
    1. Качественное обнаружение ДНК ВГВ (030102):
      1. Ранняя диагностика острого гепатита В – ДНК вируса гепатита В начинает обнаруживаться в крови больного гепатитом В в среднем на 20 дней раньше, чем HBsAg («Австралийский» антиген).
      2. Выявление мутантных штаммов вируса гепатита В.
      3. Выявление скрытых форм вирусного гепатита В.
    2. Количественная оценка уровня ДНК HBV (030104):
      1. Диагностика хронического гепатита В (вирусная нагрузка более 100000 является признаком хронического гепатита В).
      2. Мониторинг активности вирусной репликации у носителей HBsAg.
      3. Контроль эффективности противовирусной терапии.
    3. Определение YMDD мутации (устойчивости вируса гепатита В к ламивудину (030105)) - в многочисленных исследованиях установлено, что у ряда пациентов, находящихся на монотерапии зефиксом (ламивудином), возможно появление мутантного штамма вируса, устойчивого к препарату, поэтому актуальной задачей является раннее выявление таких штаммов для коррекции схемы лечения.
  3. Вирусный гепатит С (ВГС). Гепатит С редко протекает с ярко выраженными клиническими симптомами, чаще всего это случайные находки во время лабораторного обследования (обнаружение anti-HCV IgG). Учитывая всю серьезность этого заболевания (частую хронизацию процесса (85%) и возможность развития цирроза печени), становится понятным, насколько важна лабораторная диагностика в решении этого вопроса. И именно ПЦР играет ведущую роль в диагностике гепатита С позволяя:
    1. Установить факт инфицированности гепатитом С. Во-первых, это важно при обследовании контактных лиц, т.к. РНК ВГС появляется в крови больного гепатитом С гораздо раньше чем антитела, которые появляются как минимум через 2-3 месяца с момента инфицирования (период серологического окна). Во-вторых, определение anti-HCV IgG методом ИФА в некоторых случаях (часто у беременных) дает «ложноположительные» результаты, поэтому обнаружении антител к вирусу гепатита С, рекомендуется подтверждать качественным обнаружением РНК (030202), и в зависимости от результатов ПЦР определяется тактика ведения пациента.
    2. Установить наличие показаний к противовирусному лечению, а также выбрать оптимальную схему лечения. Решить эти вопросы помогают количественное определение уровня РНК ВГС (030204) (при низкой вирусной нагрузке эффективность лечения выше) и определение генотипа ВГС (030205) (генотип 1 хуже отвечает на противовирусную терапию по сравнению с генотипами 2 и 3).
    3. Своевременно оценить эффективность проводимого лечения. Так, наиболее эффективными препаратами для лечения хронического гепатита С на сегодняшний день остаются препараты интерферона в комбинации с рибавирином. Курс лечения гепатита С (генотип 1) составляет 48 недель, но уже на 12 неделе лечения врач может оценить эффективность проводимой терапии, сопоставляя результаты анализов до начала лечения и на 12 неделе лечения.
    4. Оценить устойчивость ответа на лечение. Для этого проводят обнаружение РНК ВГС после окончания лечения, через 24 недели и через 72 недели после окончания лечения.

ПЦР в диагностике ВИЧ-инфекции

В настоящее время для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции используется наиболее доступный и одновременно чувствительный подход - обнаружение в крови антител к ВИЧ с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) – anti-HIV (040601) с последующим подтверждением положительных результатов анализа методом иммуноблоттинга (ИБ). Эффективность выявления лиц, инфицированных ВИЧ, с помощью данного подхода может достигать 99% и более, что стало возможным благодаря разработке высокочувствительных и стандартизованных тест-систем для проведения ИФА и ИБ.

Однако наличие антител к ВИЧ в крови человека является лишь косвенным маркером ВИЧ-инфекции, поэтому неудивительно, что в некоторых случаях современная методология лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции может быть в сущности неинформативной. Так, известно, что в первые недели после заражения антитела к ВИЧ не могут быть выявлены методом ИФА по причине их отсутствия или низкой концентрации (период серологического «окна», который в среднем занимает от 2 до 6 месяцев). Описаны отдельные случаи ВИЧ-инфекции, когда специфические антитела не обнаруживались до 42 мес. с момента инфицирования. Кроме того, у пациентов в терминальном периоде заболевания концентрация антител к ВИЧ может значительно снижаться, что тоже приводит к ложноотрицательным результатам ИФА и ИБ.

С другой стороны, известно, что практически все тест-системы для ИФА могут давать ложноположительные результаты. Объясняют это явление присутствием в крови антител к антигенам, сходным с антигенами ВИЧ. Данная проблема решается путем дополнительного анализа всех положительных в ИФА сывороток методом ИБ. Однако при исследовании таких образцов, а также сывороток, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов во время сероконверсии (периода ВИЧ-инфекции, когда начинают вырабатываться антитела, но их количество еще не достаточно для выявления), не удается получить однозначные результаты ИБ. Согласно рекомендациям ВОЗ, сыворотки, дающие сомнительные результаты при применении метода ИБ, должны быть повторно исследованы с использованием наборов другой серии или другой фирмы. В случае повторного сомнительного результата рекомендуется наблюдение за пациентом в течение 6 мес. и повторное исследование сывороток через 3 мес. На практике это приводит к значительному удорожанию лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, а также создает известные психологические проблемы для лиц, находящихся под таким наблюдением.

Эффективность тестирования на антитела к ВИЧ снижается практически до нуля при обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей. Показано, что в крови у незараженных детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, антитела к ВИЧ могут обнаруживаться в течение продолжительного времени после рождения (до 1 года и более). С другой стороны, исчезновение антител к ВИЧ может быть вызвано гипоглобулинемией, являющейся следствием вызванного ВИЧ иммунодефицита, и поэтому не может быть основанием для снятия диагноза ВИЧ-инфекции. Поэтому такие дети должны находиться под наблюдением до 36 мес.

Перечисленные выше проблемы иммуноферментной диагностики ВИЧ-инфекции могут быть решены с помощью ПЦР.

Обнаружение ВИЧ методом ПЦР в крови возможно в двух вариантах:

  1. Обнаружение ДНК провируса ВИЧ (032101) в мононуклеарных клетках периферической крови;
  2. Обнаружение РНК ВИЧ (032102) в биологических жидкостях организма (например, в плазме или сыворотке крови).

Сейчас ПЦР на ДНК провируса ВИЧ используется как диагностическая методика для прямой диагностики ВИЧ-инфекции в следующих случаях:

  1. В период серологического "окна". Хотя следует помнить! что чувствительность ПЦР на провирусную ДНК ВИЧ колеблется от 96 до 99%, в связи с чем, несмотря на высокие показатели чувствительности, ПЦР следует проводить или совместно с ИФА или с последующим подтверждением ИФА;
  2. В случае сомнительного результата ИБ;
  3. При обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей. Использование ПЦР в этом случае позволяет сократить сроки постановки диагноза ВИЧ-инфекции с 18 месяцев до 3-6 месяцев.

ПЦР на РНК ВИЧ используется для количественного измерения концентрации вируса в крови с целью прогноза и мониторинга уже установленной ВИЧ-инфекции.

Заключение

В заключение необходимо отметить, что до сих пор идут споры о месте ПЦР в современной системе лабораторной диагностики инфекционных болезней. Однако, как мы попытались показать в настоящем обзоре, уже на данном этапе развития ПЦР является самым чувствительным и специфичным методом прямого обнаружения возбудителей, позволяющим не только устанавливать этиологию заболевания, но и осуществлять контроль за течением инфекционного процесса и оценивать эффективность проводимой терапии. Учитывая все вышесказанное, становится очевидным, что полимеразная цепная реакция является необходимым и обязательным методом обследования пациентов, и должна находиться в арсенале каждого врача, занимающегося инфекционной патологией.

Теги: pcr, пцр, хламидия, анализы, оборудование для пцр, организация пцр лаборатории, пцр диагностика, пцр системы, пцр мазок, исследование методом пцр, тест пцр, пцр методика, вирусная нагрузка при вич инфекции, высокая вирусная нагрузка, вирусная нагрузка гепатит с, пцр гепатита d, пцр диагностика гепатитов, скрытые урогенитальные инфекции, пцр в реальном времени, вирусная нагрузка при гепатите с.




Если вы обнаружили ошибку на этой странице, выделите ее и нажмите Ctrl+Enter.

Категория: Лабораторная диагностика




Добавление комментария

Имя:*
E-Mail:
Комментарий:
Полужирный Наклонный текст Подчеркнутый текст Зачеркнутый текст | Выравнивание по левому краю По центру Выравнивание по правому краю | Вставка смайликов Выбор цвета | Скрытый текст Вставка цитаты Преобразовать выбранный текст из транслитерации в кириллицу Вставка спойлера
Вопрос:
Решите пример: 9 - 4 (ответ числом)
Ответ:*
Введите код: *